Prijs voor Imke
Samen met Chemici Leuven reikt PDL elk jaar een prijs uit voor de Beste Masterstudent Biochemie & Biotechnologie. Dit jaar mocht Imke Ensinck de prijs in ontvangst nemen. Hieronder beschrijft ze het onderzoek dat ze het afgelopen jaar uitvoerde in het kader van haar Masterthesis.
FRET-gebaseerde biosensoren voor de visualisatie van cAMP/PKA-regulatie in levende cellen
Eukaryote cellen kunnen enkel groeien en overleven zolang ze inspelen op veranderingen in hun omgeving. Hierbij speelt de familie van G-proteïnegekoppelde receptoren (GPCRs) een belangrijke rol: deze eiwitten vertalen een waaier aan extracellulaire signalen, zoals licht, ionen of hormonen, tot intracellulaire prikkels.
Ondanks de grote verscheidenheid aan substraten worden de signalen door deze groep receptoren op een verrassend gelijkaardige manier doorgegeven: activatie leidt meestal tot een verandering in de concentratie van het signaalmolecule cyclisch AMP (cAMP) en beïnvloedt op die manier de activiteit van proteïne kinase A (PKA), een eiwit dat veel verschillende en zelfs tegenstrijdige effecten kan teweegbrengen. Dit ambivalente gedrag roept vragen op over hoe slechts enkele moleculen tot de gevarieerde uitkomsten van GPCR-signaaltransductie kunnen leiden en suggereert verdere ruimtelijke en temporele regulatie van zowel cAMP als PKA.
Een handig hulpmiddel voor het onderzoeken van zo'n ruimtelijke en temporele regulatie zijn biosensoren gebaseerd op fluorescente eiwitten en Förster Resonance Energy Transfer (FRET), waarbij de activatie van de sensor te volgen is met behulp van fluorescentiemicroscopie. Wanneer deze sensoren tot expressie gebracht worden in zoogdiercellijnen, kan de activiteit of concentratie van respectievelijk PKA en cAMP gevolgd worden in levende cellen. Tot slot staan cel-eigen eiwittransportsequenties ons toe deze sensoren naar specifieke locaties in een cel te dirigeren en kunnen we zogenaamde ‘gelokaliseerde sensoren’ ontwikkelen.
Om de rol van gelokaliseerde signaaltransductie op specifieke plekken in de cel te onderzoeken, werden gedurende dit project zowel bestaande als nieuwe gelokaliseerde biosensoren voor cAMP en PKA ontwikkeld, onderzocht en gevalideerd. In totaal zijn er nu sensoren beschikbaar voor zes verschillende cellulaire regio’s, waaronder de nucleus, actinefilamenten en verschillende delen van het celmembraan.
De sensoren werden getest in zoogdiercellen, waar steeds succesvol een respons werd waargenomen na stimulatie. Dankzij nieuwe analyseprocedures en correcties van het FRET-signaal kon zowel de ruimtelijke als temporele resolutie van de metingen worden verbeterd en kon intracellulaire variatie opgemerkt worden voor verschillende PKA-sensoren. Deze methodes kunnen van dienst zijn in toekomstige experimenten waar een verhoogde spatiotemporele resolutie de toepassing van FRET-gebaseerde biosensoren kan verbeteren.
De in dit project onderzochte biosensoren zullen in de toekomst een bijdrage kunnen leveren aan het onderzoek naar de spatiotemporele regulatie van GPCR-signaaltransductie. Daarnaast kan dit werk als een blauwdruk dienen voor ontwikkeling en validatie van andere gelokaliseerde biosensoren.
Imke Ensinck
