Prijswinnaar Xander Janssens werkt aan een therapie voor myeloproliferatieve ziekten
De jaarlijkse prijs voor de beste masterstudent in de biochemie en biotechnologie, gezamelijk uitgereikt door PDL en Chemici Leuven, gaat dit jaar naar Xander Janssens (foto). Xander maakte zijn masterthesis in het team van Prof. Kim De Keersmaecker. Hieronder beschrijft Xander zijn werk. Omwille van confidentialiteit van het onderzoek werden specifieke details weerhouden uit deze samenvatting.
Het genereren van een mutant JAK2-model in humane myeloïde cellen met behulp van CRISPR-Cas9
Genetische ziekten worden vaak gekenmerkt door fouten in het erfelijke materiaal van de mens. Deze fouten of mutaties in de genetische code zullen overgenomen worden in het boodschapper-RNA en zullen zich ook doorzetten in het eiwit dat vertaald wordt van dat RNA. Dat is ook het geval in myeloproliferatieve aandoeningen, bloedziekten waarbij er te veel myeloïde cellen worden geproduceerd, met een sterkt verhoogd risico op leukemie als gevolg. Die overproductie van cellen wordt veroorzaakt door een mutatie in het JAK2-gen die zorgt voor een aminozuurverandering in het JAK2-eiwit, waardoor JAK2 continu en ongecontroleerd actief is. Die verhoogde activiteit heeft als negatief gevolg dat de cellen ongecontroleerd prolifereren. Naast de rechtstreekse aminozuurverandering zijn er aanwijzingen dat de mutatie in het JAK2-gen ook een invloed heeft op het niveau van het RNA. De mutatie zou er mogelijk voor zorgen dat de translatiemachinerie het RNA foutief afleest na het tegenkomen van de mutatie, waardoor het eiwit niet de juiste aminozuursequentie zal krijgen en snel zal worden afgebroken. Een dergelijk mechanisme is reeds beschreven in virussen, maar slechts weinig begrepen in humane cellen.
Om dit mechanisme beter te kunnen bestuderen, hebben we in deze thesis getracht om de mutatie opzettelijk te creëren in het DNA van een humane cellijn via CRISPR-Cas9 (figuur). Dat systeem kan gezien worden als een moleculaire schaar die met behulp van een gidsmolecule heel gericht een stukje DNA in de cel kan herkennen en knippen. Eens het DNA geknipt is, zal de cel het terug willen herstellen. Daar heeft het echter een sjabloon voor nodig, om het DNA terug ‘na te kunnen maken’. Wanneer het sjabloon de gewenste mutatie bevat, zal de cel bij het herstellen van het geknipte DNA de mutatie overnemen in haar DNA.
Figuur: Componenten van het CRISPR-Cas9-systeem. CRISPR staat voor 'clustered regularly interspaced short palindromic repeats' (Cas9 = CRISPR-associated protein 9; dsDNA = dubbelstrengs DNA; gRNA = gids-RNA; PAM = protospacer adjacent motif) (van Marius Walter, Wikipedia, CC BY-SA 4.0)
Als eerste stap hebben we daarvoor het gidsmolecule en het mutante sjabloon ontworpen en experimenteel gevalideerd. Daarna hebben we verschillende strategieën toegepast om deze twee samen met de CRISPR-Cas9-machinerie zo efficiënt mogelijk in de cel binnen te brengen, zonder dat de cellen daar ernstige neveneffecten van ondervonden. Ondanks de covid-19-pandemie zijn we er uiteindelijk in geslaagd een cel te isoleren die de gewenste mutatie bevat. Daarenboven, als alternatief voor het experimentele werk dat niet kon worden uitgevoerd, werd ook een gedetailleerd theoretisch ontwerp van een tweevoudig-luciferasereporterassay uitgewerkt. Dat type reporterassay maakt het mogelijk om onze hypothese te testen, onafhankelijk van de eerder beschreven celmodellen.
Wanneer de omstandigheden omtrent covid-19 het weer toelaten, zal het gegenereerde celmodel verder gevalideerd worden en het reporterassay uitgevoerd worden. Dit onderzoek zal bijdragen tot het beter begrijpen van de mechanismen achter de regulatie van de JAK2-expressie. Die kennis zal in de toekomst gebruikt kunnen worden voor nieuwe therapeutische strategieën in de context van myeloproliferatieve ziekten.
Xander Janssens
